Real-time qPCR技術的定量原理：

一、擴增曲線

在Real-time qPCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號，隨著反應的進行，監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線，即為擴增曲線。

熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。

在Real-time qPCR擴增早期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化，此時即為基線期。

PCR反應過程中產生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的，隨著反應循環(huán)數(shù)的增加，最終PCR反應不再以指數(shù)形式生成模板，從而進入“平臺期”。在該時期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR的終產物量與起始模板量之間無線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出初始模板量。

只有在熒光信號的指數(shù)增長期，PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。

                                                                 擴增曲線和Ct值

二、熒光閾值

為了便于對所檢測樣本進行比較，首先需設定一個熒光信號的閾值，熒光閾值是在擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光閾值設置為3～15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，但實際應用時要結合擴增效率、線性回歸系數(shù)等參數(shù)來綜合考慮。

通常熒光閾值都是Real-time qPCR儀器自動設置，如無特殊情況，無需更改。

三、循環(huán)閾值

循環(huán)閾值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經過的擴增循環(huán)次數(shù)，Ct值與熒光閾值有關。

一般Ct值位于指數(shù)增長期的開始階段，此時樣品間細小物差尚未放大且擴增效率也相對恒定，因此該Ct值具有重復性，盡管平臺期的DNA拷貝數(shù)波動很大，Ct值卻是相對固定的。