ELISA操作流程及技術(shù)要點

　　一、實驗前準(zhǔn)備

　　試劑與耗材?：預(yù)包被酶標(biāo)板、生物素化檢測抗體、標(biāo)準(zhǔn)品、顯色液(TMB)、終止液、濃縮洗滌液等?。

　　樣本處理?：血清、血漿等樣本需避免溶血和反復(fù)凍融，細(xì)胞培養(yǎng)上清需離心去除雜質(zhì)?。

　　儀器校準(zhǔn)?：確保酶標(biāo)儀波長(如450nm)和移液器精度已校準(zhǔn)?。

　　二、標(biāo)準(zhǔn)操作步驟

　　加樣與孵育?：

　　每孔加入50μl標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本，再加入50μl抗體對混合液?。

　　封板后37℃孵育45分鐘，避免蒸發(fā)導(dǎo)致“花板”?。

　　洗滌?：

　　用300μl洗液清洗3次，每次靜置30秒，去除未結(jié)合物?。

　　顯色與終止?：

　　加入100μl TMB底物，避光孵育10分鐘?。

　　加入50μl終止液，30分鐘內(nèi)測定OD值?。

　　三、技術(shù)要點

　　加樣精度?：使用校準(zhǔn)移液器，避免氣泡和交叉污染?。

　　溫育控制?：嚴(yán)格保持37℃±0.5℃，封板膜需嚴(yán)密?。

　　質(zhì)控措施?：

　　設(shè)置陰性/陽性對照，板內(nèi)變異系數(shù)(CV)應(yīng)<5%?。

　　高濃度樣本需稀釋，避免“鉤狀效應(yīng)”導(dǎo)致假陰性?。

　　四、常見問題處理

　　高背景?：優(yōu)化封閉條件(延長封閉時間)、調(diào)整抗體濃度?。

　　信號缺失?：檢查試劑活性、孵育時間及溫度?。

　　注：以上僅供參考，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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